Secuenciación Sanger
La secuenciación del material genético ha sido uno de los grandes hitos del siglo XX. En realidad su descubrimiento ya fue un hito, pero en menos de 100 años hemos pasado de no saber que existía el ADN o cuál era el material hereditario que transmitíamos de generación en generación. De hecho, la secuenciación del genoma del ser humano ha sido un punto clave de la investigación en biología y medicina del que ya hemos hablado aquí, aquí y aquí.
A lo largo del tiempo los métodos de secuenciación han mejorado enormemente. En el año 1980 era virtualmente imposible saber la secuencia de ADN de un organismo. Sin embargo, se llevaba a cabo en el 2000 en 10 años y en 2020 era casi rutinario secuenciar completamente seres vivos en algo menos de un año. De hecho, en su momento la secuenciación completa del ADN de un ser vivo se publicaban como artículos de alto impacto científico en las revistas especializadas ahora mismo se publican muchas veces de forma gratuita para poner al alcance de la comunidad investigadora los datos.
En 1980 Frederick Sanger recibiría junto al físico Walter Gilbert el premio Nobel de química por su método de secuenciación que es fundamental para todas las herramientas y técnicas de secuenciación posteriores. El método dideoxinucleótidos o Sanger se basa en las características propias de la replicación del ADN y de los dideoxinucleótidos que son nucleótidos como los que forman el ADN pero que carecen del grupo hidroxilo y, por lo tanto, la cadena de ADN no puede elongarse.
Primero se aísla el ADN que se quiere secuenciar. Después se pone con una polimerasa que lo copiará y se añaden polinucleótidos (adenina, timina, citosina y guanina) normales y uno solo de ellos del tipo dideoxinucleótido. Esto habrá de repetirse para los 4 nucleótidos. Cuando la polimerasa empiece a copiar la cadena se unirán los nucleótidos y al azar entraran los que impiden la elongación. Cuando se para el proceso, la polimerasa se desensambla del ADN. La doble hebra que se había creado se separa y la polimerasa vuelve a empezar. De esta manera tendremos muchas copias parciales del ADN incógnita. Cada una de estas copias tendrá una longitud diferente dependiendo de cuando se ha incorporado un dideoxinucleótidos. Posteriormente, el conjunto de las copias parciales, que tenemos juntas en un mismo tubo de ensayo se cargan en un gel de electroforesis y mediante corriente eléctrica se hace migrar las cadenas de AN (que tienen carga negativa) a través del gel. La velocidad a la que “corren” dentro del gel vendrá determinada por su tamaño.
Al final tienes un gel con diferentes bandas de tamaños distintos. Comparando con un marcador de bandas con tamaño conocido podemos saber el tamaño de nuestras bandas y por lo tanto donde hay una base del tipo dideoxinucleótido. Así, con gran esfuerzo, Sanger pudo hacer de forma manual la secuenciación del bacteriófago Phi-X174 (el primer ser secuenciado de la historia) en algo más de un año que tiene 5.386 bases. En la actualidad, la mecanización del proceso permite secuenciar millones de pares de bases en tan solo días.