Electroforesis en gel de agarosa
La electroforesis en gel de agarosa es una técnica sencilla y muy utilizada en los laboratorios de biología molecular para separar por tamaño y peso cadenas de ADN o ARN u otras moléculas.
Una electroforesis es el procedimiento mediante el cual se separar moléculas dependiendo de su carga. Las moléculas, proteínas o ácidos nucleicos con mayor frecuencia, migrarán al polo positivo en una solución. En la electroforesis en gel de agarosa se hace pasar a las moléculas a través de un gel (un sólido coloidal, con una fase sólida continua y una fase dispersa líquida, como la gelatina comestible). El gel de agarosa tiene, teóricamente, una separación entre sus moléculas similar, de modo que el gel funciona como una rejilla que dificulta el movimiento de las moléculas de mayor tamaño. De esta manera las moléculas pequeñas avanzarán más rápidamente que las grandes por el gel si se les aplica una corriente eléctrica. Para separar proteínas se emplea con mayor frecuencia geles de poliacrilamida.
La agarosa es un polisacárido. Está compuesto por monosacáridos de galactosa alfa y beta que se unen en enlace covalente. La agarosa se comercializa en polvo y en los laboratorios se disuelve en tampón TBE (Tris, borato y EDTA) normalmente para separar ácidos nucleicos. Al calentar la solución la agarosa se solubiliza y funde. Dependiendo de la cantidad de agarosa que pongamos en la solución el gel será más espeso. Cuanto mayor es el porcentaje de agarosa más rápidamente correrán las moléculas de pequeño tamaño respecto a las de gran tamaño. Si nos interesan moléculas de ADN de entre 50 y 3000 pb usaremos un gel al 1%, para moléculas de mayor tamaño disminuiremos el porcentaje de agarosa para permitir que se separen mejor unas de otras.
Cuando todavía está líquida, pero ya no está caliente se le añade Bromuro de Etidio, un compuesto tóxico (cancerígeno) que se intercala entre las bases de ADN y que después puede verse a la luz ultravioleta. Si las bases son extremadamente pequeñas, menores de 100pb, se tendrá que poner un poco más de bromuro de etidio (unos microlitros más), puesto que éste se intercala entre las bases nitrogenadas y cuantas menos bases menos bromuro se unirá.
Cuando el gel está solidificado se cargan las muestras y se hace pasar una corriente eléctrica de algunos milivoltios para separar las moléculas.
Usos: en un laboratorio de biología molecular las electroforesis en agarosa son muy comunes. Se pueden usar tanto para separar fragmentos de ADN, como para comprobar extracciones o amplificaciones de material genético realizadas en un termociclador mediante PCR. En general se utilizan como medio para visualizar si se ha realizado correctamente un proceso, como una restricción enzimática de una muestra o una extracción de ARN.
En medio el marcador lambda Eco471 y a los lados digestiones enzimáticas con HindIII para comprobar que un mutante ha perdido un fragmento de ADN.
El resultado, lo que podemos observar al revelar con luz ultravioleta el gel, son bandas oscuras. Normalmente se corre junto con las muestras problemas una solución con un patrón de bandas conocido, un marcador. Algunos de los más utilizados son el ADN del virus lambda cortado con Eco471 o un marcador que presenta bandas cada 100 pb. Cada uno de ellos se emplea dependiendo de donde queramos la mayor resolución.