Secuenciación del ADN. Reacción en cadena de la polimerasa.
La secuenciación de fragmentos de unos cientos de nucleótidos de ADN se ha convertido en un procedimiento automático que llevan a cabo aparatos específicos diseñados para este fin. Gracias a la rapidez de estos métodos se ha podido secuenciar una gran cantidad de organismos, incluido el genoma humano.
El método se basa en la replicación in vitro de ADN en presencia de nucleótidos trifosfato modificados que obligan a terminar la síntesis de la cadena. El objetivo es obtener una mezcla de moléculas de diferentes tamaños en la que se encuentren terminaciones en todos y cada uno de los nucleótidos de la cadena. La adición de distintas sustancias químicas coloreadas a los nucleótidos terminadores permite leer la secuencia, ya sea a simple vista o con lectores ópticos acoplados a ordenadores . Estos últimos, han permitido la fabricación de los llamados «secuenciadores de ADN», que permiten acelerar el proceso de forma notable.
Hibridación de ácidos nucleicos.
El ADN es una molécula bastante resistente a condiciones extremas. A 100 °C, los puentes de hidrógeno que mantienen unidas las dos cadenas del ADN se debilitan y las cadenas se separan. Esta reacción es reversible, y las cadenas pueden volver a juntarse en condiciones de reasociación, generalmente, a una temperatura de 65 °C.
El ARNm que se copia de una de las cadenas de ADN puede aparearse con la cadena de ADN que ha servido como molde para su formación en condiciones de reasociación, formándose moléculas híbridas ADN-ARN.
Esta propiedad proporciona uno de los métodos más sensibles para la búsqueda de un gen determinado en una molécula de ADN
Reacción en cadena de la polimerasa.
El rápido desarrollo de las técnicas implicadas en la replicación de ADN ha permitido la multiplicación de fragmentos de una determinada longitud en un tubo de ensayo hasta obtener gramos de moléculas partiendo, en ocasiones, de una sola molécula.
Esta técnica se conoce abreviadamente como la técnica de la PCR (Polymerase Chain Reaction) y fue desarrollada por Kary Mullis (Premio Nobel en 1993).
Para esta reacción se necesita disponer de:
- Iniciadores: pequeñas moléculas de ADN de cadena simple complementarias a cada uno de los extremos 3″ de la región que se quiere copiar.
- ADN polimerasa de una bacteria, Thermus aquaticus (Taq), que resiste temperaturas de 100 °C.
- Los cuatro deoxiribonucleótidos trifosfato.
- Una disolución tampón adecuada, a pH fisiológico y condiciones salinas adecuadas.
La técnica consiste en introducir el tubo con la muestra que sea en un pequeño aparato que regula la temperatura en ciclos: de forma que primero se sube la temperatura para que se separen las cadenas de ADN, y luego se baja para permitir que los iniciadores se unan al ADN y para que se copie el ADN molde. Terminada la copia se vuelve a reanudar el ciclo, haciendo que suba la temperatura a 100 °C, con lo que las copias recién replicadas se desnaturalizan y estas se utilizan como ADN molde, amplificando la reacción. Realmente es una reacción exponencial.
Mediante la PCR conseguimos amplificar la cantidad de ADN de una muestra