PCR en tiempo real, PCR cuantitativa o qPCR
La PCR a tiempo real o RT-PCR (del inglés real time PCR) también se conoce por el nombre de qPCR (de PCR cuantitativa, del inglés quantitative). Incluso como RT-Q-PCR.
Aunque ambos nombres son correctos RT-PCR puede crear cierta confusión con la RT-PCR (cuando se refiere a una PCR con RetroTranscriptasa) cuyo objetivo es muy distinto al de la qPCR. La RT-PCR pues sirve para retrotranscribir RNA en ADN, al que se llama cADN, o ADN copia. Por eso es aconsejable llamarla qPCR para evitar confusiones.
La qPCR es una mejora tecnológica basada en los procedimientos básicos de la PCR tradicional. Para saber más sobre ella puedes leer nuestros artículos: Reactivos de la PCR aquí y ¿qué ocurre dentro del termociclador? aquí.
Empezando por el principio:
La qPCR se emplea cuando queremos comprobar la cantidad de transcrito de ARN que se está generando de un determinado gen. Por ejemplo queremos comprobar que un determinado gen de Arabidopsis thaliana, una planta muy común en laboratorios, se expresa más en determinadas condiciones de temperatura. En ese caso se crecerían plantas en diferentes condiciones de temperatura.
Después se extraería el ARN de las plantas y se realizaría una RT-PCR (con retrotranscriptasa). Una vez obtenido el cDNA se buscarían oligos (pequeñas secuencias de ADN de unos 20 nucleótidos de longitud) que su cadena fuera complementaria al ARN del gen que queremos estudiar. A poder ser estos oligos diferenciarán entre ADN genómico y ARN para, en el caso de que el ARN no fuese muy puro, poder diferenciar los productos de PCR de uno y el otro.
Entonces ya se puede hacer la qPCR. El cDNA (de cadena sencilla) de las plantas con diferentes tratamientos se pondría con los oligos, en una reacción similar a la de la PCR convencional. En el caso de la qPCR además se añade SYBR green, uno de los reactivos que se emplean para revelar ADN en los geles de agarosa. El SYBR Green se une inespecíficamente al ADN y es un fluorocromo; tiene la capacidad de emitir luz verde cuando se le excita con luz azul. Normalmente el kit comercial para hacer qPCR incluye en el mismo recipiente la mezcla del SYBR Green, la polimerasa (de alta precisión) y los dNTPs a la concentración necesaria para la reacción.
La técnica se basa en la incorporación al termociclador de un emisor de haces de luz de longitud de onda determinados. Esta luz (de 488nm) estimulara al SYBR Green que esté unido a ADN de doble cadena (el que se va formando) y hace que emita luz verde (de una longitud de onda de 522 nm). Esta luz será captada por un receptor del termociclador y registrará las variaciones en la cantidad de luz en cada ciclo de replicación del ADN. Cada vez que el ADN es copiado por la polimerasa el número de copias de ADN de doble cadena aumenta y por lo tanto aumenta la luz.
El termociclador de qPCR va unido a un ordenador con un software capaz de recopilar todos los datos que se producen durante la reacción.
Se llama de tiempo real puesto que tras cada ciclo de replicación se obtiene la cantidad de luz “en tiempo real” o lo que es lo mismo la cantidad de ADN de doble cadena de la muestra. Si nuestro gen varia su expresión con la temperatura obtendremos luz antes en los pocillos con mayor expresión del gen.
Para saber más sobre la qPCR puedes leer nuestro artículo sobre el qué diferencia una qPCR de una PCR normal aquí.