Biología

Inicio Biotecnología, Técnicas en biología Diferencias de preparación de una qPCR y una PCR normal

Diferencias de preparación de una qPCR y una PCR normal

Publicado por Ramón Contreras

La reacción en cadena de la polimerasa -PCR- es uno de los grandes avances científicos del siglo XX y posiblemente de buena parte del siglo XXI. Este procedimiento permite la replicación de cadenas de ADN o ARN, clonándolas y amplificando su número para una plétora de experimentos que cada día son más. Hemos dedicado algunos artículos básicos al tema, como los reactivos de la PCR o qué pasa dentro del termociclador, la máquina donde se lleva a cabo la PCR.

Un tipo especial de PCR es la PCR en tiempo real, PCR cuantitativa o qPCR. Esta PCR permite, gracias a un termociclador especialmente preparado y a unos reactivos luminiscentes comparar la cantidad de una secuencia de nucleótidos y compararla con otra. Esto supone una prueba directa de qué genes se están expresando en la muestra determinada -en las que se juega cambiando las condiciones de crecimiento del cultivo del que se extrae el ARN para que se expresen diferentes genes-.

El protocolo de una qPCR es ligeramente diferente al de una PCR normal, aunque su funcionamiento es básicamente el mismo. Para empezar en la qPCR se emplea una polimerasa -la enzima que copiará la cadena de nucleótidos- muy sensible y con poco error de copia.

El otro gran cambio entre la PCR normal y la qPCR es que esta última no hay necesidad de revelarla en un gel. A la muestra se le añade un cromóforo, frecuentemente SYBR-Green. La formación de la cadena copia genera la carga necesaria para que el cromóforo se ilumine. Esto permite que el termociclador sea capaz de percibir cuando se está emitiendo luz y la intensidad a la que se emite. La qPCR compara siempre varias muestras. El termociclador permite ver en que ciclo de replicación empieza a emitirse luz y la variación en la cantidad de luz en cada ciclo. Viendo las gráficas de emisión de luz de varias muestras simultáneas se puede determinar cuál es la que más luz -y por lo tanto más cantidad de un transcrito tiene-.

Sin embargo, la qPCR tiene unos requerimientos técnicos mucho mayores que una PCR. Para empezar las muestras no pueden estar contaminadas en lo más mínimo, puesto que la polimerasa es muy sensible. Además, la qPCr necesita muchos menos ciclos por lo que incluso pequeñísimas cantidades de contaminación -o ya puestos de degradación de la muestra- podrían alterar la concentración de la muestra y por lo tanto el resultado.

Por otro lado, la extracción tiene que ser muy limpia, no solo para evitar la contaminación y la degradación de la muestra. La cantidad de ARN, o ADNc, que se pone como muestra debe ser extremadamente similar entre las muestras a comparar. Por lo que es frecuente que tenga que medirse su concentración y preparar las muestras especialmente.

Para acabar con las preparaciones específicas de una qPCR la comparación entre dos muestras -el tratamiento que sea y el control- debe hacerse en base a una referencia común. Para ello se emplean genes que se expresen de forma constituyente -que su expresión no varíe entre el tratamiento y el control-.

Finalmente, las qPCR requieren réplicas técnicas, normalmente 3 por cada gen y muestra, de esta manera se puede evitar los posibles errores de “pipeteo”, las diferencias de medición debidas al propio trabajo de medir las muestras y preparar todos los tubos que se introducirán en el termociclador.

Aunque el proceso biológico o técnico de una qPCR es el mismo que el de una PCR, el objetivo es mucho más concreto y la preparación ha de ser mucho más precisa.

Categorías: Biotecnología, Técnicas en biología