Que pasa dentro del termociclador
En un termociclador caben unas 96 muestras.
Tradicionalmente, se lleva a cabo la amplificación de una cadena de bases nitrogenadas en tres pasos.
Antes de empezar los ciclos de amplificación se realiza un paso previo. En él se ponen las muestras a una temperatura superior a 90 grados centígrados, normalmente a 94 – 98ºC, de esta manera las dos hebras que componen la cadena nitrogenada, ADN o ARN, se separan y además se deshace cualquier conformación secundaria que haya adquirido el ADN, circularizaciones o emparejamiento de una hebra consigo misma. Este paso tiene una duración grande para asegurar la separación de todos los motivos que se hayan podido formar, entre 30 segundos y 2 minutos.
Ciclos de amplificación:
El primer paso vuelve a ser un paso de desnaturalización, que si bien en el primer ciclo no es muy importante en los ciclos siguientes separará las hebras que se hayan formado. Este paso suele hacerse también a una temperatura alta, 94 o 98 ºC y dura más o menos diez segundos.
El segundo paso es la alineación de los oligos o primers en la hebra molde que queremos amplificar. Este paso dura unos 20 segundos y se lleva a cabo a una temperatura variable, puesto que depende de la secuencia de los primers que se usan. En inglés este paso se llama annealing, y muchas veces se traduce demasiado literalmente como anillado.
Los primers son las pequeñas secuencias de unos 20 nucleótidos que hemos comprado o fabricado que se unirán a la secuencia que queramos amplificar. Los primers reconocen la secuencia de nuestro gen de interés, se pegan a ella por apareamiento de bases homólogas y mediante la actividad de la elongación de la polimerasa se copia el gen. Los primers suelen utilizarse en parejas, uno para copiar la hebra positiva y el otro la negativa.
Como decíamos la temperatura de este paso es variable, dependiendo de los primers. El fabricante que los facilita suele añadir algunos datos sobre los oligos. Como el porcentaje de GC o la “Tm”, temperatura de melting, a la que teóricamente la mitad de las hebras están formando cadenas sencillas, es decir, es la temperatura a la que con seguridad los primers no tienen configuraciones secundarias. Por eso se emplea una temperatura un poco superior a la Tm para este paso, que muchas veces es una temperatura que ronda entre los 55ºC y los 65ºC hasta los 72ºC.
El tercer paso es, lógicamente, la elongación de la doble hebra de 20 pares de bases creada en el paso anterior, para ello se usa una temperatura de unos 72ºC, que es la temperatura óptima de trabajo de la Taq polimerasa y de otras polimerasas, aunque las polimerasas suelen ir acompañadas de las especificaciones de uso donde lo pone. La elongación tiene un tiempo variable, siendo aconsejable un minuto por kilobase, mil bases, del gen que queramos amplificar y la Taq se recomienda para secuencias cortas de hasta 4 Kb máximo, puesto que a partir de ese punto pierde la eficacia.
Tras este paso lo más frecuente es volver al primer paso de 98ºC durante 10 segundos y repetir el ciclo entre 30 y 45 veces.
Al final de los ciclos se suele añadir un paso de calor, 72ºC durante unos 7 minutos para separar las hebras del ADN de la polimerasa y de los primers. Después de deja en un paso de frio, de entre 15 y 4ºC con tiempo infinito, para mantener la muestra en buen estado hasta que se vaya a recoger.