Northern blot
EL Northern blot es una técnica de separación de ARN. Gracias a ella podemos a partir de una muestra biológica, de cualquier organismo, podemos aislar un ARN en particular si conocemos al menos parte de su secuencia. Además permite separar los ARN dependiendo de su tamaño.
El Northern blot surge como variación del Southern blot, una técnica similar creada para separar moléculas de ADN. El Southern recibe su nombre de su creador, E. Southern. El Northern se denominó de esta manera como oposición (norte y sur) al Southern. La técnica para separar el ARN fue diseñada por James Alwine, David Kemp y George Stark, a finales de la década de 1970. Además existen otras técnicas basadas en la misma tecnología para separar proteínas, el western, o ARN con modificaciones postranscripcionales, el Eastern blot, etc. Puedes leer más sobre el Southern blot aquí y sobre el western blot aquí .
Para poder realizar un Northern blot es necesario el conocimiento previo de algunas técnicas de laboratorio. Para empezar la muestra biológica ha de ser sometida a un tratamiento de extracción de ARN, eliminando las proteínas y el ADN . EL ARN es muy sensible a la degradación y por eso se ha de trabajar en condiciones de esterilidad mayores de las habituales en un laboratorio. Las ARNasas, enzimas capaces de degradar el ARN son altamente frecuentes.
Una vez extraído el ARN de la muestra, éste queda en suspensión en agua. A continuación lo cargaremos en un gel de agarosa al que se ha añadido formaldehido para que el ARN pierda su estructura secundaria. De esta manera corre en el gel dependiendo de su tamaño exclusivamente. Puedes leer más sobre los geles de agarosa en nuestro artículo aquí. Si el ARN que queremos separar es de pequeño tamaño puede utilizarse poliacrilamida en lugar de agarosa. De esta manera puede conseguirse un diámetro de poro menor.
Las cubetas empleadas para el Northern blot son las mismas que para el Western y el Southern
Una vez separados los ARNs según su tamaño es el momento de hacer el blot. Para ello utilizaremos una membrana de nailon u otro material capaz de retener fuertemente las moléculas de ARN. Normalmente los enlaces que se establecen entre el ARN y la membrana son covalentes. El paso del ARN desde el gel a la membrana se realiza con corriente continua para aumentar su velocidad. La membrana se coloca sobre el gel. Y se embebe todo en un buffer salino que mejorará la conductividad del proceso. Así mientras los ARN van del gel hasta la membrana los ARN mantendrán su separación por peso.
Utilidad: Tras la transferencia la membrana puede revelarse con sondas específicas de un ARN concreto para comprobar que ese ARN se estaba expresando en el tejido del que proviene la muestra. Su uso para establecer patrones de expresión de diferentes ARN en un tejido y poder comparar la expresión entre tejidos es muy extendido. Gracias al Northern podemos separar diferentes productos de splicing alternativo de un mismo gen o ver bajo que circunstancias ambientales se expresará un gen de interés.
El Northern blot es una técnica que lleva muchos años usándose. El único problema que presenta es la fragilidad del ARN durante el proceso. Existen alternativas modernas al Northern. Por ejemplo los microarrays o la qPCR (PCR cuantitativa), aunque estas técnicas solo mostrarán la cantidad de ARN, por lo que no separarían los diferentes tamaños de ARN.