Western blot
En biología molecular se emplea una técnica para separar y aislar proteínas, el Western blot o hibridación western. Gracias a esta técnica podemos separar una proteína de peso molecular conocido a partir de una muestra de tejido de cualquier ser vivo (que es una mezcla compleja de todas las proteínas sintetizadas en ese tejido).
El western blot es una técnica análoga al Southern blot, de la que puedes leer más en el artículo que le dedicamos aquí. El Southern blot fue inventado por el Dr. en biología Edwin Southern y sirve para detectar secuencias específicas de ADN. El nombre de la técnica, Western blot, hace alusión a su similitud de procedimiento y sobre todo intelectual con el Southern. Otras pruebas similares son el Northern blot para separar secuencias de ARN y el Estern blot para ARN modificado durante la transcripción.
Lo primero para realizar un western blot es obtener una muestra de tejido fresco. Normalmente se introduce en nitrógeno líquido para su rápida congelación. De esta manera evitamos la degradación de las proteínas. Seguidamente se añade un buffer (un tampón salino) que contiene beta-mercaptoetanol, que impide que las proteínas se degraden. En este punto la muestra se homogeniza, se deshace mecánicamente la muestra para romper las membranas celulares y para solubilizar las proteínas en el buffer.
Una vez extraídas las proteínas se carga la muestra en un gel vertical de poliacrilamida. La poliacrilamida es un polímero frecuente en las electroforesis (técnicas de separado de moléculas por su carga eléctrica). La corriente eléctrica hace que las proteínas contenidas en la muestra migren a través del gel de poliacrilamida a una velocidad diferente dependiendo de su peso molecular y su potencial eléctrico. Siendo las proteínas más grandes (que tendrán más cargas) las que menos migren al polo positivo. De esta manera se obtiene una columna con las proteínas separadas por peso molecular.
El paso siguiente es transferir las proteínas a una membrana porosa estéril (tiene el aspecto de un papel grueso). Esta parte es la conocida como “blot” y es común a todas las técnicas mencionadas al principio del artículo. También mediante el paso de electricidad se hace mover, esta vez horizontalmente, las proteínas desde el gel de poliacrilamida a la membrana.
Finalmente si la proteína que se quiere aislar es conocida se realiza una inmunodetección. En primer lugar se bloquea la membrana con leche o algún producto similar con alto contenido proteico inespecífico. A continuación la membrana se lavará con buffer, la membrana nunca debe quedar seca y se pondrá en una suspensión de anticuerpos para nuestra proteína concreta. Estos anticuerpos, se habrán sido hechos en rata, ratón, cabra o conejo, normalmente. Tras una larga incubación con el anticuerpo se vuelve a lavar el exceso de anticuerpo. Finalmente se emplea un anticuerpo contra el anticuerpo del animal que toque, este segundo anticuerpo suele llevar unido algún tipo de sustancia que reacciona a la luz o capaz de impresionar una placa fotográfica.
Al final se revela la membrana con soluciones fotográficas y se expone la película fotográfica en oscuridad. Si todo a salido bien obtendremos una banda exclusivamente a la altura del tamaño esperado de nuestra proteína.
Esta técnica se usa con frecuencia en la investigación científica para, por ejemplo, demostrar que un tejido expresa un proteína determinada.