Cómo funciona una qPCR y qué es el Ct, ciclo umbral, con el que detectamos un ADN o un ARN dentro de una muestra
La PCR es una técnica muy potente. Permite amplificar cadenas conocidas de ácidos nucleicos (ADN o ARN), mediante el uso de sondas específicas. Sin embargo, hoy vamos a hablar de una de las “mejoras” de la PCR tradicional, la PCR cuantitativa en tiempo real, comúnmente llamada qPCR, por lo de cuantitativa.
El termociclador de qPCR va unido a un ordenador con un software capaz de recopilar todos los datos que se producen durante la reacción.
La qPCR combina dos cosas. Por un lado el revelado constante de la cantidad de material genético que se ha sintetizado gracias a fluorocromos que producen luz cuando se unen al híbrido entre la secuencia de interés y la sonda que producimos en la PCR. Esto lo haremos gracias a un sistema de detección incorporado en la máquina.
Además, es importante destacar que la qPCR es una técnica altamente sensible y específica. Esto significa que puede detectar incluso pequeñas cantidades de material genético en una muestra, y puede diferenciar entre secuencias de ADN o ARN muy similares. Esto la hace ideal para aplicaciones como el diagnóstico de enfermedades infecciosas, donde es crucial poder detectar la presencia de un patógeno específico en una muestra.
Por otro lado, tendremos una amplificación de la secuencia de interés muy estudiada que nos permite establecer cantidades de ADN a partir de la luz que nos dan los fluorocromos. En una qPCR el “pipeteo”, la cantidad exacta que echamos de cada componente será vital para que salga bien, puesto que de la concentración inicial de ácidos nucleicos de la muestra dependerá el resultado, saber la cantidad concreta de nuestra secuencia de interés en el conjunto de la muestra.
La amplificación de los ácidos nucleicos sigue una curva sigmoide. Esto quiere decir que cada ciclo de la PCR la cantidad de ácidos nucleicos aumenta siguiendo una curva en forma de S. Durante los primeros ciclos la cantidad de copias de la secuencia de interés es muy baja y la fluorescencia que producen se confunde con el “ruido” de fondo del tubo.
A medida que se hacen más copias, su número empieza a crecer de forma lineal, en la parte media de la curva sigmoide y dura solo de 4 a 6 ciclos. El ciclo en el que empieza el crecimiento lineal es conocido como ciclo umbral, Ct, (de Treshold cycle) o punto de corte, Cp, (de crossing point).
La qPCR también tiene aplicaciones en la investigación genética y en la medicina forense. En la investigación genética, puede utilizarse para medir la expresión de genes específicos, lo que puede ayudar a entender cómo estos genes están regulados y cómo pueden estar implicados en ciertas enfermedades. En la medicina forense, la qPCR puede utilizarse para identificar individuos a partir de muestras de ADN, lo que puede ser crucial en la resolución de crímenes.
En este punto pueden empezar las mediciones de fluorescencia y el aumento de la fluorescencia en cada ciclo será directamente proporcional a la cantidad de secuencia de interés en la muestra. Por eso decimos que a mayor cantidad de secuencia de interés más pequeño será el Ct, son inversamente proporcionales. Cuanta más secuencia diana tengamos antes empezaremos a ver una fluorescencia por encima del ruido de fondo porque el número de copias será suficiente para iluminar la muestra.
Pasados esos 4-6 ciclos, la fluorescencia se estabilizará, entraremos en una fase de meseta. Volveremos a una zona de crecimiento muy lento de la cantidad de híbridos sonda y secuencia diana. Esto se da por un conjunto de factores como que casi no quedan sustratos para la PCR o a la pérdida progresiva de actividad de la polimerasa que sintetiza los híbridos.
La PCR cuantitativa en tiempo real permite tras cada ciclo observar la fluorescencia de la muestra. La máquina tiene un ordenador incorporado que recoge la cantidad de fluorescencia de cada muestra y crea una gráfica con la cantidad de luz por ciclo, dando como resultado la curva sigmoide. Cuando empezamos a detectar la fluorescencia por encima del fondo pasamos el Ct. Sabiendo en qué ciclo hemos cruzado el Ct podemos extrapolar la cantidad de nuestra secuencia de interés (este es el dato que buscamos) dentro de la muestra (de la que sabemos la concentración de todos los ácidos nucleicos que contiene).