Diseño de sondas o cebadores para PCR
La preparación de sondas para PCR es uno de los pasos clave para el éxito de la técnica. La PCR es la técnica más usada en todos los laboratorios de biología molecular y con ella amplificamos, reconocemos e incluso somos capaces de contar la cantidad de un ADN problema. Su versatilidad y potencia la hacen la técnica reina, no en vano es la técnica que nos permitía detectar el virus SARS-Cov-2 durante la pandemia. Puedes leer más sobre la técnica de PCR en los artículos que le hemos dedicado ya aquí.
Mediante la PCR conseguimos amplificar la cantidad de ADN de una muestra
La PCR amplificará de forma selectiva un fragmento de ADN de nuestra elección. Para hacerlo hay que crear sondas que se sitúen a los lados de la región que queremos copiar. La pega de esto es que hay que conocer la región que queremos amplificar y esto solo puede hacerse si antes se ha secuenciado (se ha cogido el ADN y se ha mirado a ver las bases nitrogenadas que forman esa secuencia).
Los cebadores, primers o sondas son indispensables para copiar un ADN (amplificarlo) porque la enzima encargada de hacerlo en la naturaleza (y la que usaremos en el laboratorio) no puede copiar un ADN monocatenario sin más. Esta polimerasa necesita que haya una pequeña región de doble cadena para unirse al ADN y luego sigue uniendo bases nitrogenadas a la cadena más corta. [En los organismos esto crea los fragmentos de Okazaki]. La sonda se une a ADN cuyas bases son complementarias, la polimerasa se une al híbrido formado entre la sonda y el ADN y a partir de ahí irá copiando la secuencia de ADN larga y pegando nuevas bases a la cadena del cebador.
Estos cebadores tienen que tener un tamaño pequeño pero lo suficientemente grande para que sean específicos (exclusivos) del ADN que queremos copiar. Para ello se considera que deben tener unas 20 a 30 bases, con menos de 16 la sonda es muy inespecífica y puede unirse a regiones muy diferentes a la que queremos copiar.
Para amplificar una región concreta de ADN tenemos que acotarlo de alguna manera, puesto que el ADN es una cadena realmente grande de bases nitrogenadas. Para ello empleamos dos cebadores, uno a la “izquierda” y otro a la “derecha” de la región que queremos amplificar. A la izquierda la llamamos aguas arriba, del inglés upstream, o en el extremo de lectura 5″. A la derecha lo llamaremos aguas abajo, downstream, o el extremo 3″. El primer que se una aguas arriba recibirá el adjetivo “Forward” o “upper” y el de aguas abajo será el reverse o down.
El ADN está formado por dos cadenas, un primer se unirá a una de estas cadenas y permitirá su copia, creándose la cadena complementaria. Es por eso que hay que hacer 2 primers, para copiar ambas cadenas. A la hora de diseñar los primers y como la polimerasa lee desde el extremo 5″ al 3″ haremos que los cebadores sean complementarios de ambas cadenas. En una hebra de ADN tenemos una cadena que va de 5″ a 3″ y otra que va al revés, de 3″ a 5″. Para leer esta segunda cadena hay que diseñar el primer al revés, para que la polimerasa pueda leer la cadena de 5″ a 3″.
