Pasos para extraer ADN: homogenizar las muestras y romper (lisar) las membranas celulares
La extracción y purificación del ADN es un proceso casi rutinario en la mayoría de laboratorios moleculares. Este procedimiento puede llevarse a cabo de forma casera con muy pocos materiales. Si lo hacemos en casa y todo sale correctamente, al final obtendremos una medusa o moco blanquecino en suspensión en el agua. En el laboratorio obtendremos una cantidad menor de ADN, pero también mucho más puro. En el laboratorio, una vez extraído el ADN se comprueba su pureza y su integridad.
El ADN es una molécula compleja, pero extraerla es relativamente sencillo
Para extraer y purificar ADN lo primero que hay que hacer es homogeneizar la muestra. Normalmente partiremos de tejidos, ya sean animales o vegetales, o de bacterias y levaduras, pero estos últimos son más fáciles de homogeneizar. Lo primero que haremos será transformar el sólido, el tejido, en un líquido homogéneo, poniendo agua como medio y deshaciendo el tejido. Por ejemplo, si partimos de sangre, que es un tejido líquido, no necesitaremos homogeneizarlo. Para deshacer el tejido se puede emplear tanto la fuerza mecánica, con un mortero por ejemplo, como la química. Si lo hacemos químicamente tenemos que emplear compuestos que rompan las uniones entre las células y que degraden la matriz extracelular. El objetivo es disgregar las células que forman el tejido, así que todo vale.
Una vez tengamos las células del tejido sueltas, flotando en nuestra solución de homogeneización, pasaremos a romper las células. El ADN se encuentra en el interior de las células, en procariotas bastará con romper la membrana plasmática, pero en eucariotas se tendrán que romper la membrana plasmática y la doble membrana que forma la envoltura nuclear. Y todavía más, en bacterias, levaduras y vegetales las células estarán protegidas por la pared celular, así que también tendremos que deshacernos de ella. Dependiendo del tipo de pared celular usaremos unas enzimas u otras para llevarla a cabo. Por otra parte, para deshacer la membrana plasmática se emplean detergentes. La membrana está constituida principalmente por fosfolípidos, y los detergentes deshacen las gotas de grasa, por lo que parece lógico que funcione para lisar ( o romper la membrana de) las células. El detergente más utilizado es el SDS, pero en ocasiones puede usarse en combinación o completamente sustituido por el CTAB, que además de romper membranas tiene actividad contra las paredes celulares.
Cuando lisamos las células añadiremos otros compuestos que ayudarán a preservar el ADN que ya puede empezar a quedar desprotegido. Estos compuestos serán el EDTA, que será un quelante de iones que usan algunas enzimas que degradan ADN, como la ADNasa o también existen diversas nucleasas, y añadiremos también proteasas, la más usada es la proteínasa K, una enzima que degrada proteínas que podrían degradar el ADN y también proteínas presentes en la membrana celular.
Si todo ha ido llegados a este punto tendremos el ADN flotando en nuestra solución. Pero ahora toca eliminar el resto de los componentes celulares que siguen por ahí flotando. Nos referimos a trozos de membrana citoplasmática, proteínas inactivadas, y en general todos los componentes que tiene una célula que ahora están desparramados dentro de nuestro líquido. Los siguientes pasos a seguir incluirán la purificación del ADN y su posterior verificación. Como has podido comprobar la homogenización del tejido y la lisis celular son bastante sencillas y en realidad pueden realizarse juntas, usando los compuestos de lisis celular y de disgregación de las células juntos. De hecho, algunos de ellos, como el SDS, el CTAB o la proteasa, son útiles contra la matriz celular.