¿Qué lleva el TBE y para qué sirve cada ingrediente? Tampón para electroforesis en gel de agarosa
La electroforesis es una técnica básica de los laboratorios de análisis, ya sean clínicos como de investigación. Esta técnica permite separar moléculas, normalmente ácidos nucleicos o proteínas, dependiendo de su carga, que muchas veces se relaciona con su peso. Los dos tipos de electroforesis básica difieren del medio en que se corren las muestras, pueden ser en agarosa o en PAGE-SDS, siendo la primera la usada para los ácidos nucleicos y la segunda las proteínas. Ya hemos comentado esta técnica en otras ocasiones y puedes leerlo aquí.
Si no se usan quelantes el ADN se degrada y en el gel veremos el «smear» o mancha continua.
Para la electroforesis en gel de agarosa hay que hacer un gel, que como su nombre indica, el elemento que creará la malla a través de la que pasará el ADN será la agarosa. Sin embargo, la agarosa es un polvo blanco y debe ser disuelto para formar el gel (hasta tener una consistencia de gelatina). El líquido en el que se disolverá la agarosa es conocido como buffer o tampón TBE. Este tampón es muy fácil de preparar y hoy vamos a ver sus ingredientes, por qué se añade cada uno y su función en la electroforesis.
El nombre de TBE viene de los 3 compuestos que lo forman (es un tampón muy sencillo): Tris, borato y EDTA.
El primero de ellos, el Tris, es la abreviatura de tris(hidroximetil)aminometano. Es un compuesto orgánico sencillo, cuya fórmula química es (HOCH2)3CNH2. Cuando se disuelve en agua tiene un pH entre 7 y 9. El Tris, gracias a su pH cercano al pH neutro, será idóneo para conservar la estructura de las moléculas de origen biológico (puesto que nuestras moléculas tienen un pH ligeramente ácido, cercano a 7). Existen dos formas comerciales del Tris: Tris base y Tris-HCl. Ya puedes intuir la diferencia. Efectivamente, el Tris base tiene un pH más cercano a 9, es más básico, mientras que el Tris-HCl, está mezclado con ácido clorhídrico (HCl) por lo que su pH es más ácido. El Tris-HCl bien puede venir así de fábrica o realizarse en el laboratorio añadiendo HCl al Tris base. Con el ácido clorhídrico ajustaremos el pH del Tris para situarlo cercano al pH al que queramos mantener las muestras.
Esto nos lleva al segundo ingrediente del tampón TBE, el borato. Este compuesto químicamente tiene esta configuración (BO3)3-. Esta base conjugada del ácido bórico se emplea por dos motivos, en primer lugar por su capacidad para seguir tamponando el pH, corrigiendo o sustituyendo al HCl si queremos conseguir un pH más básico. Pero también el borato se unirá a posibles iones positivos presentes en el agua o en la muestra, principalmente magnesio. El magnesio (Mg2+) es un cofactor de la actividad de muchas enzimas nucleasas (enzimas que cortan el ADN o el ARN, muy comunes en la naturaleza).
Finalmente, el tercer ingrediente del TBE es el EDTA. Este compuesto, cuya formulación química es C10H16N2O8, es específicamente un quelante de metales pesados, de nuevo, como el Mg2+. El EDTA es un quelante que suele incluirse en la extracción de ADN o ARN precisamente para evitar la acción de las nucleasas. Para evitar su acción (puesto que es muy fácil la contaminación con estas enzimas ubicuas) nos aseguramos que no tengan el factor que necesitan para actuar, quitándoles el magnesio con EDTA.