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Hibridación in situ fluorescente

Publicado por Ramón Contreras

La hibridación in situ, es la manera más directa de estudiar la localización cromosómica de secuencias de DNA (únicas o repetidas). Se pueden observar preparaciones de cromosomas metafásicos con su DNA desnaturalizado. El marcaje con fluorescencia: FISH (fluorescence in situ hybridisation) utiliza fluorocromos como agentes intercalantes (que se intercalan en las hebras de ADN). Un fluorocromo es una sustancia capaz de fluorescer, como las pegatinas que brillan en la oscuridad. Menos utilizada en la actualidad por los peligros que acarrea es la hibridación in situ con sustancias radioactivas.

La teoría detrás de esta técnica es que la sonda marcada (una secuencia, conocida y creada por el investigador, de ADN unida a una o varias moléculas del fluorocromo) se unirá a las secuencias homólogas que encuentre en nuestro ADN problema. Para ello necesita poder acceder a la cromatina. Por eso lo primero es tener nuestro ADN problema fijado en un portaobjetos para microscopio de fluorescencia, además tiene que desnatralizarse, normalmente con formamida, para que se separen las dos cadenas de la doble hélice.

La detección puede ser directa: el fluorocromo directamente unido a la sonda de ADN .

En la detección indirecta: la sonda está unida a una molécula que por técnicas inmunohistoquímicas se unirá a anticuerpos que llevarán el fluorocromo unido. El método indirecto tiene la ventaja de que permite aumentar el número de moléculas de fluorocromo por sonda de ADN, por lo que es más visible al microscopio, es más estable y no decae la luminiscencia , pero es mucho más caro.

Las sondas se marcan para la detección indirecta con biotina o con digoxigenina, y en la directa con un fluorocromo, que puede ser por ejemplo: Fluoresceína (que fluoresce en color verde), DAPI (azul), Rodamina (rojo) o Texas red (rojo), que son los más comunes. En condiciones de hibridación la sonda se pega al DNA problema y se lava el exceso de sonda.

Las sondas han de ser grandes (~ 40 kb ), generalmente se sintetizan en cósmidos. El poder de resolución es de varias megabases (1Mb =1.000.000).

Aplicaciones: conociendo la secuencia de un gen resulta una forma fácil de encontrar en otra especie un gen análogo sin necesidad de secuenciar todo su genoma. Permite mapear el orden de varios genes unos respecto a otros o ver que gen está implicado en una alteración o identificar cada cromosoma mediante secuencias específicas (que dan colores diferentes). Gracias a este método se puede apreciar por ejemplo que el cromosoma 19, el de mayor densidad génica se sitúa en el centro del núcleo, puesto que tiene más actividad transcriptómica que otros cromosomas. Por otra parte el cromosoma 18, que tiene una muy baja densidad génica, se observa que se coloca en la periferia del núcleo. También permite estudiar las relaciones evolutivas entre cromosomas, utilizando grandes trozos de cromosomas o en algunas ocasiones cromosomas enteros: por ejemplo una sonda humana del cromosoma 8 hibrida en una secuencia de un cromosoma de platarrino (primates de América). O se puede observar que una gran el cromosoma 7 humano mantiene la posición relativa de sus genes en el cromosoma correspondiente de chimpancé.

Por lo tanto se puede afirmar que la hibridación in situ fluorescente a dado lugar a grandes avances en la identificación de enfermedades y al conocimiento del funcionamiento del núcleo no solo durante la división celular sino también cuando los cromosomas se descondensan.

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