El dot blot, el primer análisis de mutaciones genéticas
La detección de huella genética es una de las pruebas rutinarias que se realizan para múltiples situaciones como determinar el sexo de embriones, determinar la presencia de determinadas enfermedades genéticas relacionadas con cambios en la secuencia de bases nitrogenadas, diagnóstico de cáncer y estudios de expresión génica (para determinar qué genes se expresan en en un momento determinado, ante unas condiciones concretas en un tejido o tipo celular específico). Sin embargo, antes de llegar a las pruebas actuales en las que se analizan miles de genes o secuencias de ADN al mismo tiempo la técnica ha tenido que evolucionar mucho desde un trabajo artesanal hasta la informatización del proceso. Por eso hoy en Laguia2000 hablaremos del Dot blot, el primer paso para la determinación de mutaciones genéticas.
El resultado positivo del dot blot será la aparición de puntos, uno por cada sonda-muestra unida
El dot blot es una técnica relativamente sencilla que sirve para identificar una sola mutación o alteración en una secuencia genética determinada. Para ello se basa en la capacidad de la sonda (una secuencia de ADN conocido y marcado para poder revelarse) de unirse o hibridarse con una secuencia de ADN diana, aquella en la que queremos saber si hay una alteración de algún tipo. Los marcadores más empleados han sido de forma tradicional los radiactivos (ya hemos dicho que esta era la primera aproximación ala detección de alteraciones de ADN y por lo tanto se creó cuando el estudio con radiactividad estaba en su momento álgido).
El protocolo del dot blot empieza con la desnaturalización del ADN. Para que la sonda pueda unirse al ADN hay que separar las dos cadenas que lo forman. Posteriormente aplicaremos la muestra (ADN resuspendido en agua) en una membrana de nitrocelulosa o nylon, que retendrá el ADN durante todo el ensayo.
A continuación se empleará un tampón de prehibridación para bloquear cualquier posible unión inespecífica a nuestro ADN problema. Para ello se suele emplear extracto de esperma de salmón que unirá cualquier compuesto que pueda secuestrar a la sonda en lugar de nuestra muestra.
Por fin, realizamos la hibridación. Si la sonda es de doble cadena hoy que desnaturalizarla primero. En cualquier caso una vez está la sonda preparada se incuba en un tampón que favorezca la hibridación entre las cadenas de ADN de la muestra, fijadas en la membrana, y la sonda libre para moverse sobre la muestra y encontrarse con el ADN.
Una vez incubada la hibridación, proceso que puede durar hasta 24 horas, hay que quitar las sondas que no se han unido a la muestra. Para ello se realizan varios lavados sucesivos con soluciones acuosas. Es normal que estas soluciones sean cada vez más restrictivas. De esta manera cada vez eliminaremos las sondas que se hayan unido menos a la membrana y al acabar el último lavado solo contaremos en la membrana las sondas que se hayan unido muy fuertemente, o lo que es lo mismo, se hayan unido completamente a las secuencias diana.
Finalmente revelaremos el ensayo. Este paso dependerá del tipo de marcador que hemos unido a la sonda. En el caso de emplear radiactividad, por ejemplo si hemos creado la sonda con timidina tritiada, se revelará con un contador de centelleo. Si por el contrario se ha realizado la prueba con haptenos se puede revelar con un método cromogénico (que dará puntitos de color, por eso se llama “dot” de punto en inglés).
Este es el protocolo para hacer un dot blot, el southern blot, el northern blot y el microarray son evoluciones de esta técnica que aumentan su capacidad de análisis y la especificidad de la detección.