Cómo se comprueba la calidad del ADN después de extraerlo
Cuando extraemos y purificamos ADN o ARN ya sea en el laboratorio para realizar experimentos, ya sea en casa para divertirnos una tarde, podemos luego mirar la calidad de nuestra extracción. La determinación de la calidad de los ácidos nucleicos purificados es un proceso crítico en cualquier experimento que involucre la manipulación de ADN o ARN. La calidad de los ácidos nucleicos puede afectar significativamente la precisión y la fiabilidad de los resultados experimentales. Por lo tanto, es importante realizar una evaluación rigurosa de la calidad de los ácidos nucleicos antes de utilizarlos en experimentos posteriores.
Existen varios métodos para determinar la calidad de los ácidos nucleicos purificados. Uno de los métodos más comunes es la espectrofotometría UV-Vis. Este método mide la cantidad de luz absorbida por los ácidos nucleicos a diferentes longitudes de onda. La absorbancia a 260 nm se utiliza para medir la concentración de ADN, mientras que la absorbancia a 280 nm se utiliza para medir la concentración de proteínas. La relación entre la absorbancia a 260 nm y la absorbancia a 280 nm (A260/A280) se utiliza para evaluar la pureza del ADN. Una relación A260/A280 de 1,7 a 2,0 se considera óptima para el ADN purificado. La calidad del ARN se evalúa de manera similar a la del ADN. La relación A260/A280 de 1,8 a 2,1 se considera óptima para el ARN purificado. Conjuntamente con la pureza se suele medir la cantidad. Puesto que la absorbancia depende de la cantidad de muestra y dependiendo del tipo de ácido nucleico, ADN de cadena simple o doble, o ARN, se puede extrapolar la cantidad que hay en la muestra. Todo esto se puede hacer con un nanodrop, una máquina de laboratorio especialmente diseñada para esto.
El ADN deja un rastro en el carril según la cantidad de degradación que tenga
Otro método para evaluar la calidad del ADN o del ARN es la electroforesis en gel de agarosaElectroforesis en gel de agarosa. Este método separa las moléculas de ADN por tamaño y carga eléctrica utilizando un campo eléctrico aplicado a través de un gel de agarosa. Las moléculas de ADN se mueven a través del gel y se separan según su tamaño, lo que permite la visualización y el análisis de las bandas de ADN. Un ADN de alta integridad debe mostrar una banda única y bien definida en un gel de agarosa. Mientras que un ADN degradado mostrará una pátina en todo el carril debido a que existen trozos de ADN de diversos tamaños. En el caso del ARN intacto debe mostrar dos bandas claras y bien definidas correspondientes a los ribosomas 28S y 18S. Mientras que en el ADN la pátina por todo el carril es un signo de degradación, en el ARN es normal que las bandas no sean tan claras como en elADN, esto es debido a los ARN mensajeros que tienen un tamaño variable y se distribuyen por todo el carril, pero sin llegar a ser suficientes para dar lugar a bandas concisas.
Para evaluar la calidad del ARN también se puede usar un analizador de integridad de ARN. Este dispositivo mide la integridad del ARN mediante la detección de fragmentos cortos de ARN utilizando microfluidos. El analizador de integridad de ARN proporciona una puntuación de integridad del ARN (RIN, por sus siglas en inglés) que varía de 1 a 10, donde 10 representa el ARN más intacto y 1 representa el ARN más degradado.
Además de estos métodos, también se pueden utilizar técnicas adicionales para evaluar la calidad de los ácidos nucleicos purificados. Por ejemplo, la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) Cómo funciona una qPCR y qué es el Ct, ciclo umbral, con el que detectamos un ADN o un ARN dentro de una muestrase puede utilizar para medir la cantidad de ADN o ARN específico en una muestra y determinar si está presente en cantidades suficientes para su uso en experimentos posteriores. La PCR también se puede utilizar para evaluar la presencia de contaminantes en una muestra, como ADN o ARN de origen bacteriano o fúngico.
Siempre que se vaya a emplear después en experimentos será necesario evaluar la extracción y la purificación con el propósito de confirmar nuestros esfuerzos y seguir o no con la muestra.