Reactivos de la PCR
En la mayoría de los trabajos científicos actuales en el campo de la biología, y en especial de la biología molecular, resulta imprescindible realizar algún tipo de experimento en el que se necesite una PCR.
PCR son las siglas del inglés Polymerase Chain Reaction. Esta reacción en cadena realizada por la polimerasa permite amplificar un trozo de ADN, conocido o no, que después puede ser visto y aislado a partir de un gel de agarosa y bromuro de etidio (BrEt), un agente que se intercala entre las vueltas de la hélice de ADN y que permite su visualización con rayos UV.
La idea de este proceso, clave del desarrollo experimental en ciencia, surgió de la mente de Kary Mullis, al que se le concedió el premio Nobel de Química en 1993 por ella.
La amplificación de un segmento de ADN o de ARN en una PCR se lleva acabo en un termociclador, una máquina que varia la temperatura interna siguiendo unos ciclos asignados por el investigador, de esta manera los tubos que se colocan en su placa van alterando su temperatura para facilitar uno u otro proceso de la PCR.
¿Qué se necesita para hacer una PCR?
Los reactivos necesarios para llevar a cabo una PCR son muy “sencillos”. En primer lugar necesitamos una enzima polimerasa que sea capaz de copiar una secuencia de nucleótidos, existe una gran variedad de polimerasas con diferentes capacidades y eficacias a la hora de trabajar con diferentes temperaturas o no equivocar la base que se introduce. La más habitual es la polimerasa de la bacteria Thermus aquaticus, abreviada Taq, capaz de funcionar a altas temperaturas con una precisión de 1 error cada millón de pares de bases, aunque las secuencias a amplificar recomendadas son de 1000 pares de bases para minimizar el error. Para conseguir una alta fidelidad es común usar la polimerasa Phusion, mucho más cara, pero mucho más rápida y con menor frecuencia de error.
En segundo lugar se requieren los nucleótidos sueltos que la polimerasa utilizará para formar la cadena copia. Los nucleótidos tienen que estar en forma de dNTPs (deoxiribonucleotidos trifosfato).
Además se utiliza un buffer, una solución específica que magnifica la actividad de la polimerasa, normalmente contiene cloruro de magnesio.
Pero para que la polimerasa funciones tiene que existir una secuencia de doble hélice con un extremo 5’ monocatenario. Para conseguir esto se utilizan unos oligos, pequeñas secuencias de nucleótidos, de entre 20 y 50 bases, que unirán nuestro ADN. Estos oligos, que llamamos primers, por ser los que se unen los primeros, pueden ser una secuencia conocida en un gen de interés (sacada de alguna base de datos de genomas y fabricados para la ocasión) o bien pueden ser oligos de bases al azar, cuando se quiere aumentar el número de copias de todo el ADN o ARN que contenga la muestra. Como curiosidad para coger solo el ARN mensajero, mARN, a veces se usan oligos de poliT, que se unirán a las colas de poliA de los ARN que van a ser traducidos.
Por supuesto una de las cosas más importantes que se ha de añadir a la mezcla antes de ponerlo en el termociclador es el ADN o el ARN que se quiera copiar. Si la muestra que se introduce es ARN lo que obtendremos será un cADN, un ADN copia, que en lugar de uracilo tendrá timina.
Los pasos que se dan dentro del termociclador para llevar a cabo esta amplificación del material genético leelos aquí.
Esto es lo que tiene que haber en un tubo en el que se vaya a llevar a cabo una PCR, todo esto está inmerso en agua purificada, del tipo MiliQ