Enzimas de restricción
Una enzima de restricción es una enzima con función endonucleasa, es decir, es capaz de reconocer una secuencia concreta de ADN y realizar un corte en ambas hebras del ADN. Estas enzimas son propias de todos los organismos. Las de bacterias está ampliamente estudiadas y son una herramienta fundamental en los laboratorios, puesto que gracias a ellas se puede trocear el ADN tanto para introducir una secuencia de interés, como para eliminar secuencias.
El lugar de reconocimiento de secuencia de un enzima de restricción no suele estar muy alejado del lugar de corte, siendo lo normal que sean la misma secuencia. Esta secuencia suele ser de entre 4 y 12 nucleótidos con una capacidad de reconocimiento de secuencia que varia entre distintas enzimas. Algunas enzimas cortan tan solo una secuencia concreta, por ejemplo la enzima BamhI reconoce exclusivamente en la secuencia GGATCC y su punto de corte es entre las dos guaninas de la secuencia de reconocimiento. Otro caso de enzima de restricción, pero que en este caso permite cierta variación en su secuencia de reconocimiento es AarI, cuya secuencia de reconocimiento es GACNNNNNNGTC, donde N es cualquier nucleótido. Como se observa, las zonas de reconocimiento deben tener el mismo significado, el mismo orden de bases, en su cadena positiva y en la negativa en sentido 5’ -> 3’, puesto que la enzima tiene que poder leer la cadena sin importar la hebra.
Una de las funciones naturales de estas enzimas es proteger al organismo de virus y de intercambios genéticos no deseados. Para evitar estos eventos el genoma suele carecer de dianas de los enzimas de restricción que lo protegen o si hay, cosa casi inevitable, suelen estar marcados por metilación para que no sean atacados. Por otra parte algunos enzimas de restricción solo actúan en dianas de restricción metiladas.
La nomenclatura con que se nombran las enzimas de restricción está formada por 3 letras, una letra adicional y un número, las tres letras especifican el género (la letra correspondiente al género siempre va en mayúsculas) y la especie, la letra siguiente, que va en mayúsculas, corresponde a la cepa y el número en números romanos indica el orden de identificación de ese enzima. Por ejemplo EcoRI quiere decir que es una enzima de restricción que se caracterizó en Escherichia coli, en la cepa RY13 y I, que fue la primera en identificarse en EcoR.
Las enzimas de restricción más frecuentes son un complejo multiproteico que pueden ser de tres tipos dependiendo de las acciones que pueda llevar a cabo.
El tipo 1 puede tanto cortar como metilar la secuencia para marcarla como “cortada”. Estos enzimas son los más grandes y el sitio de reconocimiento está a unas 100 bases de distancia del sitio de reconocimiento, para moverse por el ADN de un sitio al otro requieren gasto de ATP. Además necesitan cofactores para su funcionamiento, Mg++ y SAM (S-adenosil-metionina).
Las de tipo 2 no son capaces de metilar el ADN. No necesitan ATP, pero sí ambos cofactores. El sitio de reconocimiento y de corte es el mismo.
Este es el sitio de reconocimiento y de corte de EcoRI, dejando dos extremo cohesivos de 4 bases.
Las de tipo 3 son un complejo oligomérico cuya diana está a unas 25 bases del sitio de reconocimiento, requiere dos secuencias de reconocimiento en oposición, para su funcionamiento requiere SAM, Mg++ y ATP.