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Clonación del ADN

Publicado por Javier García Calleja

Entendemos por clonación del ADN o clonación génica, la obtención de múltiples copias de un gen o de su producto génico, usualmente una proteína.

La estrategia que se emplea consiste en colocar un fragmento de ADN portador del gen en cuestión dentro de una molécula de ADN extracromosómico autorreplicante (por ejemplo un plásmido bacteriano), acompañado de genes que permitan la selección de las moléculas híbridas, en el interior de una bacteria, que puede multiplicarse a gran velocidad formando un clon (grupo de células con los mismos genes) y permitir que la maquinaria de la bacteria transcriba y traduzca el segmento de ADN que le hemos introducido. Para ello se necesitan:

La insulina humana se obtiene hoy día por los procedimientos descritos en este artículo.

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  • Vectores de clonación: son pequeñas moléculas de ADN autorreplicantes. Deben tener, además, sitios de rotura con enzimas de restricción y genes de resistencia a antibióticos, u otro gen que nos resulte útil para distinguir qué bacterias han incorporado el ADN que queremos clonar y cuáles no. Pueden usarse como vectores plásmidos bacterianos, partículas virales y cromosomas eucarióticos de levadura («YAC»). Su empleo viene determinado por el tamaño del fragmento que se desea clonar y por la facilidad de expresión del ADN en un vector o en otro. Si el vector se requiere como vector de expresión, debe tener también un promotor fuerte para que haya transcripción de las secuencias insertadas. Entendemos por promotor la secuencia del gen que induce a la fabricación de la proteína buscada. Para lograr la unión del fragmento de ADN y el vector, se rompen ambas moléculas con la misma enzima de restricción. Si ésta genera extremos cohesivos, en condiciones de reasociación, ambas moléculas tenderán a juntarse. La enzima ADN ligasa facilita la formación del enlace fosfodiéster, que asegura la continuidad en cada cadena del ADN híbrido formado.
  • Selección del ADN que se va a clonar. Puede ser un segmento de ADN de secuencia conocida que contenga el gen de interés. En muchos casos, cuando se trata de ADN de células eucarióticas, la presencia de intrones hace muy difícil que la bacteria pueda procesar el ARN antes de traducirlo, ya que le falta la maquinaria enzimática adecuada. En estos casos resulta provechoso aislar el ARN mensajero que codifica a la proteína de interés, y hacer una copia de ADN del mismo mediante la transcriptasa inversa. Esta copia se llama ADNc (ADN complementario), no tiene intrones y expresa la proteína correctamente dentro de bacterias.
  • Introducción de las moléculas híbridas en el huésped. Las moléculas híbridas generadas se introducen en bacterias o células de levadura para su replicación, previa permeabilización de las mismas por tratamientos químicos.
  • Selección de los clones con moléculas híbridas. Los clones híbridos se seleccionan por alguna propiedad que el investigador ha introducido en las moléculas, por ejemplo, resistencia a un antibiótico o tras detectar hibridación positiva con oligonucleótidos complementarios a las secuencias de ADN exógeno.
  • Expresión de proteínas de interés. La bacteria o el huésped eucariótico no distinguen el ADN extraño del propio, y la maquinaria celular continúa el programa genético de replicación, transcripción y traducción de los genes que se han introducido. En algunos casos, se ha logrado una expresión de una proteína hasta el 1 por 100 del total de proteínas del huésped. Utilizando técnicas de ingeniería genética, se puede lograr que la bacteria secrete la proteína al exterior de la bacteria. De este modo se pueden conseguir rendimientos de proteína extraordinarios en procesos industriales.

Actualmente, el factor VIII (proteína que requieren los hemofílicos), la hormona de crecimiento, la insulina humana y algunas vacunas antivirales se obtienen por este procedimiento.

Categorías: Biotecnología